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人/猴抗I型膠原和II型膠原IgG抗體ELISA試劑盒
發布時間：2021/3/9
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人/猴抗I型膠原和II型膠原IgG抗體ELISA試劑盒
Human/Monkey Anti-Type I and Type II Collagen IgG Antibody ELISA Kits with TMB
Catalog # Catalog # 1031T, 1032T, 1033T, 1035T, 2051T, 2052T, 2053T, and 2055T
產品簡介：
人血清，特別是自身免疫性疾病患者的血清，含有高水平的免疫成分，在ELISA檢測中造成高背景。這些非特異性反應是由人血清中的粘附性免疫球蛋白引起的，這些免疫球蛋白通過親水性結合在塑料板表面，而牛血清白蛋白（BSA）和吐溫20（Tween20）也不能阻斷這些非特異反應。由血清樣本本身引起的假陽性反應通常被忽略。即使現在，在許多情況下也被認為是真正的抗原-抗體反應。為了獲得抗原抗體反應的真實值。以下幾點很關鍵1)選擇合適的阻斷劑，有效的阻斷這類非特異性反應。2）用包被孔檢測每個樣品的背景值3）用試劑盒確定的相應值減去該背景值。此外，確定二抗的背景值也很重要。Chondrex公司的ELISA試劑盒包含*的阻斷劑，可抑制這些血清成分和塑料表面的疏水性結合，并通過非包被孔測定背景值。
一般來說，人血清中的膠原對異種抗原（例如：牛或雞I型和II型膠原）高度特異型，并且與其他種類和類型的膠原（包括人膠原）有交叉反應（與疾病無關）。例如：即使是健康正常人的血清抗體也會對不同種類和類型的膠原蛋白發生反應。為了確定血清中特定抗原的抗體水平。Chondrex公司提供各種種屬的I型和II型膠原包被板和無包被板。此試劑盒提供可供2個塊檢測板的試劑量，可用于人和后血清樣本檢測。
試劑盒組分：
組分 | 數量 | 規格 | 保存溫度 |
IgG 抗體標準品(7010) | 1 | 1.1 ml, 16 units/ml | -20℃ |
二抗（Biotin-羊抗人IgG）(7014) | 2 | 凍干粉 | -20℃ |
溶液A-封閉液（9027） | 1 | 20ml | -20℃ |
溶液B-樣本/標準品稀釋液(9038) | 1 | 50ml | -20℃ |
溶液C-二抗稀釋液（9039） | 1 | 20ml | -20℃ |
溶液D-鏈霉親和素稀釋液（9055） | 1 | 20ml | -20℃ |
鏈霉親和素-HRP(9029) | 2 | 50ml | -20℃ |
TMB(90023) | 2 | 0.2ml | -20℃ |
顯色緩沖液（90022） | 1 | 20ml | -20℃ |
終止液-2N硫酸（9016） | 1 | 10ml | -20℃ |
洗滌液20x(9005) | 2 | 50ml | -20℃ |
I型或II型膠原包被板 | 10 | 8聯孔 | -20℃ |
未包被8聯孔 | 10 | 10 | -20℃ |
標準品參照孔（2條/次） | 4 | 8聯孔 | -20℃ |
包被板和設置
種屬 | I型膠原顏色編碼-Cat# | II型膠原顏色編碼-Cat# |
雞 | Gold-1031T | Yellow-2051T |
牛 | Dark Blue-1032T | Green-2052T |
豬 | Brown-1033T | Pink-2053T |
人 | Siver-1035T | Blue-2055T |
未包被 | Clear | Clear |
標準 | Red | Red |
標準ELSIA（Standard ELISA Kit）試劑盒（I型膠原或II型膠原單一種屬）
標準ELISA試劑盒 含5列未包被的8聯孔作為對照孔，用于評價樣本中的背景值，5列包被了I型膠原或II型膠原的8聯孔用于檢測膠原抗體的含量。2列標準品。“B”代表作為空白孔，用于檢測由二抗引起的非特異性反應。標準品和樣本全部做復孔。
定制ELISA試劑盒（多種屬膠原）
定制ELISA試劑盒用于檢測人血清中的不同種屬的人I型或II型膠原。此試劑盒含2列未包被孔，2列人，雞，牛II型膠原包被板孔，和2列標準品孔。“B”代表作為空白孔，用于檢測由二抗引起的非特異性反應。
用前須知：
- 推薦標準品和樣本做復孔檢測。
- 所有緩沖液用前置于室溫平衡。
- 20X洗液低溫時可能會有結晶析出。如果有結晶析出，將瓶置于溫育水中，直至結晶全部溶解。
- 用移液器準確定量提供的緩沖液，提供額外的緩沖液。
- 每個步驟結束后，用封板膜封板，防止蒸發。
- 如果只是用部分試劑，請參照操作步驟中的用量，做相應的使用量緩沖液配制。未使用的儲液在原包裝管內保存，置于-20℃保存。
- 試劑用完，做生物安全處理
操作流程：
1.加入封閉液：加100ul封閉液（Solution A）到各孔，室溫孵育1小時。
2.制備標準品稀釋液：未稀釋的標準品儲液濃度是16U/ml。在250ul的16U/ml的稀釋液中加入250ul的SolutionB-8U/ml，依次制備系列標準品，4,2,1,0.5和0.25U/ml標準品。16U/ml標準品-20℃標準品-20保存，用于下次實驗。
3.制備樣本稀釋液：血清樣本10000 rpm室溫離心3min 去除不容物和脂類。樣本1:100稀釋或用Solution B 稀釋到進一步稀釋。例如：取10ul樣本加入0.99ml Solution B(1:100)。作為儲液用于后續實驗。如果可以，樣本可以稀釋到1:200~1:1000。
4.洗液稀釋：50ml 20X稀釋加入950ml雙蒸水（1X稀釋）。用稀釋后的洗液（1X稀釋）至少洗板三次。倒置微孔板，倒掉孔內液體，在吸水紙上拍干。不要讓板干燥。
5.加入標準品和樣本：加入100 ul標準品，SolutionB(空白)和樣本到孔內，做復孔。室溫孵育2小時。
6.洗滌：用1X洗液至少洗板三次，倒置微孔板，倒掉孔內液體，在吸水紙上拍干。不要讓板干燥。
7.加入二抗：用10ml Solution C(溶液C) 溶解1管二抗。或者取一管二抗溶于50ulSolution C(溶液C)中，根據實際情況稀釋。加入100ul溶解后的二抗稀釋液到各孔，室溫孵育1小時。
8.洗滌：用1X洗液至少洗板三次，倒置微孔板，倒掉孔內液體，在吸水紙上拍干。不要讓板干燥。
9.加入HRP標記的鏈親和素：取一管HRP標記的鏈親和素，溶于10ml鏈親和素稀釋液中。
10.用1X洗液至少洗板三次，倒置微孔板，倒掉孔內液體，在吸水紙上拍干。不要讓板干燥。
11.TMB:用10ml顯色緩沖液稀釋TMB加入100ul TMB。洗板后立即加入100ul TMB到各孔。室溫孵育15min。
12.終止：加入50ul 2N 硫酸（終止液）到各孔。
13.讀板：讀取450nm處的OD值。如果樣本OD值比大標準品的OD值還高，對樣本稀釋后重新檢測。630nm作為副波長。
計算抗體滴度：
1.計算標準品，空白孔和檢測樣本的均值。
2.樣本值，標準品減去空白值。注：每種抗原有對應的空白值。因此，空白孔用于各自的不同抗原。
3.從第二步，用包被孔中的OD值減去未包被孔中的樣本OD值（背景值），除去非特異性反應。
4.標準品OD值做縱坐標，標準品值（U/ml）做橫坐標。用log/log模式擬合曲線。圖1 為例圖，標準品范圍0.25-16U/ml。
5.通過回歸方程計算樣本中抗體濃度。
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