Biocoat腫瘤侵襲系統(tǒng)

BD 產品貨號：354166, 354165

儲存和運輸：-20度儲存，干冰運輸。

使用指南:

BD Biocoat^TM 腫瘤侵襲系統(tǒng)由包被Matrigel基質的特殊材質BD FluoroBlok 熒光屏蔽8.0μm PET膜的培養(yǎng)小室組合而成。BD Biocoat^TM 腫瘤侵襲系統(tǒng)具有以下特點：提高腫瘤細胞侵襲實驗的通量；自動化非破壞式的熒光檢測；節(jié)約抗腫瘤轉移藥物篩選的時間和勞動力；高度可重復性：平均z’=0.7(24孔)；平均z’=0.66(96孔)；使用簡便：無需反復取液和操作，僅需加入細胞、標記物，然后直接讀板。

操作過程:

凍融

從-20℃冰箱中取出產品，使其自然升溫到室溫。取出培養(yǎng)板在細胞小室內加入到500μL 37℃預熱的PBS，37℃無CO2環(huán)境下孵育2小時。解凍后，小心去除小室內的培養(yǎng)基，避免破壞Matrigel基質膜。

BD鈣黃綠素Calcein AM熒光染色劑后標記法

細胞通過侵襲消化基質膜后遷移到下小室，采用熒光標記定量細胞。細胞的侵襲能力用終點計算法計算得到。對于采用實時動力曲線的計算，推薦使用前標記法。

2.1 如步驟1準備培養(yǎng)板。

2.2 胰酶消化細胞單層后制得細胞懸液，溶于無血清DMEM培養(yǎng)基，推薦濃度為5×104 cells/mL。

2.3 上小室中加入500μL細胞懸液（2×104 cells）。

2.4 通過進樣口在下小室中加入750μL誘導劑。

2.5 在37℃，5%CO2 條件下孵育培養(yǎng)板和對照板20-22小時（由細胞類型決定）。

2.6 孵育后，小心去除上小室中的培養(yǎng)基。避免破壞Matrigel基質膜?？梢酝ㄟ^反扣住培養(yǎng)板，輕輕拍打，以使培養(yǎng)基的傾倒。

2.7 將培養(yǎng)小室轉移到另一塊24孔板中，該孔板含有0.5 mL每孔的4μg/mL 鈣黃綠素（溶于HBSS）。在37℃，5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)一小時。

3、DilC12（3）熒光染色劑預標記法

細胞接種于孔板之前先用染色劑標記，可用于均一化實驗，所產生的實時動力數(shù)據(jù)可揭示細胞通過基底膜侵襲的動力曲線，不需要分解和破壞各個時間點。

3.1如1.所示凍融。

3.2 10μg/mLDilC12(3)溶解于含10%FBS的DMEM中，37℃ 1小時標記單層細胞。

3.3 胰酶消化細胞單層，制備細胞懸液，溶于無血清DMEM培養(yǎng)基，濃度為1×105 cells/mL。

3.4 上小室加入500μL細胞懸液（5×104cells）。

3.5通過進樣口在下小室加入750μL誘導劑。

3.6 在37℃，5%CO2環(huán)境下孵育培養(yǎng)板和對照板18-24小時（由細胞類型決定）。在549激發(fā)波長和565nm發(fā)射波長條件下進行熒光讀數(shù)。

4、數(shù)據(jù)計算

侵襲率%=受趨化劑誘導通過Matrigel基質膜的細胞平均相對熒光值/受趨化劑誘導通過未包被FluoroBlok熒光膜的細胞平均相對熒光值×100

注意：數(shù)據(jù)可以用相對熒光值RFU或侵襲百分比表示，后者在標準化數(shù)據(jù)處理中更有用。背景扣除，計算平均背景值，將其從各個孔板中扣除。

自動化操作注意事項

BD Falcon FluoroBlok 24孔板培養(yǎng)小室系統(tǒng)能適用于自動化操作系統(tǒng)。蓋子可以用標準機械手取走，也可用吸力取走。為了避免各孔間污染，孔板設定為一個統(tǒng)一的方向。為了與培養(yǎng)小室匹配，確保Falcon的商標均在2者上方，面向同一個方向。任何規(guī)格的槍頭都能達到小室的兩邊。包括50μL，100μL，200μL，250μL，1000μL。